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CASA精子濃度精確測定原理

精子濃度(Sperm concentration)的定義是:每單位體積(ml)精液中精子的數目。

精子濃度測定原理:假設精液充分混勻后每單位體積中的精子數目相同。那么在10um深度的玻片中(精子是單層的),一個顯微視野(面積為A um2)下的精子數目N(個)是可以人工或計算機數出來的。

那么計算精子濃度C的公式為:C=100N/A(10^6/ml)。

測量精子濃度時有2個方面特別重要:

A、確保精液充分混勻;這方面主要由實驗室控制,

B、確保測量單個顯微視野面積A的準確性,該方面由CASA測定,每臺CASA的A值都應該單獨測定。

我們以測定CASA攝像機在顯微鏡下的單個視野面積為例介紹一下精確測量方法。

小知識:攝像機記錄的顯微視野的面積(A)通常由以下幾個方面決定:

1、物鏡倍數:物鏡倍數越大那么能看到的顯微鏡下的視野面積就越小;測量濃度我們采用的是10x相差物鏡;

2、攝像機靶面大小:攝像機的靶面面積越大,所能拍攝的視野面積就越大;例如:我們采用的Basler sca780-54fc/gc的靶面大小為1/2寸。

3、轉接口(連接攝像機與顯微鏡):轉接口的倍數越大,所能顯示的視野越小;通常由0.5x,0.75x,1x,我們采用的轉接口的倍數為1x(1倍)。

通過這三個方面查詢硬件的相關參數可以直接計算單個顯微視野的面積大小,看似精確,但是我們不能這么做!

原因就是:任何物理設備所標定的值都不是絕對準確的,這三個物理設備的標稱值都可能有偏差,譬如物鏡倍數10倍,但實際上,它可能是10.1倍,10.2倍,9.8倍,而精液濃度計算時,也許就是幾微米的差別也能使濃度差上數百萬個/ml。

我們需要選擇的方法是直接測量法:

正確方法:

在顯微鏡下放上測微尺,通過測微尺和測距軟件測量視野的實際長度和寬度從而計算視野的面積A大小。

原理:測微尺上的每個刻度的長度是一定的假設單位長度為D,那么當截取了顯微鏡視野的照片后,可以用專用軟件測量出圖像在軟件中圖像長度L,寬度W,重復測量3個單位刻度(確保準確)在軟件中的長度分別為D1,D2,D3,那么顯微鏡視野的真實長度Lr=(3×L×D)/(D1+D2+D3)(公式變形)Wr==(3×W×D)/(D1+D2+D3),

那么顯微視野面積A=Lr×Wr

步驟:

1、將顯微鏡測微尺放在載物臺上,調節焦距至最清晰;

2、將測微尺靠邊垂直對中,并拍攝顯微視野照片;

3、將該圖片導入測距軟件中;

以本圖為例:



以穗加CASA為例,采用Ph10x相差物鏡,Basler scA780-54fc攝像機,1x轉接口,

本測微尺的單位刻度長度為D=0.01mm(10um),圖上測量:L=206.35,W=153.44,D1=3.1785,D2=3.1822,D3=3.1868

則:Lr=648.29(um),Wr=482.06(um),

面積A=312515.29(um2)

用測距軟件的優勢是:排除目測法的主觀性,精確測量每一個長度。

CASA對攝像機要求

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CASA測定精子濃度

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